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标题: 生物医学3D打印现状——我们离活体器官打印还有多远？ [打印本页]

作者: 苗苗 时间: 2016-5-25 10:12
标题: 生物医学3D打印现状——我们离活体器官打印还有多远？
引言

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近日生物3D打印技术接连获得突破，先是开发出能替代软骨的3D打印生物玻璃材料，接着科学家成功打印胎盘用于先兆子痫病的研究。学术界捷报频传，生物3D打印技术的发展日新月异，那我们究竟离可以打印一个活体的心脏还有多远呢？安美生物医学3D打印特别整理了这篇科普类综述，简要介绍了目前生物医学3D打印的技术和市场应用现状，希望对生物医学3D打印领域感兴趣的同仁有所帮助！
1、什么是生物医学3D打印

3D打印是快速成型技术的一种，它是一种以数字模型文件为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术。所谓生物医学3D打印，主要是其使用的材料与传统3D打印不一样，高层次的生物医学3D打印主要使用生物相容性材料、活细胞、蛋白及生长因子等生物材料。具体来说，生物医学3D打印是以三维设计模型为基础，通过软件分层离散和数控成型的方法，用3D打印的方法成型生物材料。根据所使用的材料类型，目前生物医学3D打印的产品包括各种医用模型、手术导板、假肢、组织支架、人造组织甚至是人造器官等等。

生物医学领域的3D打印技术以解决医疗领域的具体问题为目的，其终极目标是通过整合医学、工程学、电子学、生物学等多学科技术来实现“打印” 出一个跟人的器官或者组织完全一模一样的替代品，该替代品可用于组织修复，器官移植等。例如，3D打印的皮肤组织可用于替代烧伤的皮肤，3D打印的肝脏组织、或肾脏组织等可用于器官移植以治疗肝癌，肾功能衰竭等疾病。生物医学3D打印除了利用传统3D打印的核心技术以外，其制造过程必须符合生物学的规范和标准，打印出的组织不仅要保证细胞活性、增殖能力、表型、甚至还能定向分化形成具有完整生物学功能的器官。因此，生物医学3D打印技术远远超过简单的用3D打印来制造模型，其对各种技术的整合也存在着巨大的挑战，代表着目前 3D打印技术的最高水平。

2、生物医学3D打印技术应用概况

生物医学3D打印技术自1995年出现以来，主要包括四个层次的打印技术。第一层次：非植入物打印，主要包括一些医学模型、医疗器械，这些产品对使用的材料没有生物相容性的要求；第二层次：不可降解植入物打印，主要包括一些骨科、整形科的修复或替代产品，其使用的材料具有良好的生物相容性但是不能被降解，产品植入人体后成为永久性植入物；第三层次：可降解植入物打印，主要包括各种组织支架、水凝胶等，使用的材料具有良好的生物相容性，而且能被降解。产品植入人体后，可以与人体组织发生相互关系，促进组织的再生；第四层次：具有生物活性植入物打印，主要包括各种人体组织和器官。其制造过程使用的材料包括活细胞、蛋白及其他细胞外基质，打印出的产品具有生物活性，经过培养和训练可形成具有完整生物学功能的器官，这是生物3D打印的最高层次。

纵观国内外的生物医学3D打印市场，目前四个层次的3D打印技术均有相关的代表性公司，如图1所示。在现阶段，第一到第三层次的技术发展已比较成熟，已经进入到实际应用层面。第四层次的技术水平尚处于“概念产品”阶段，产品主要停留在科研机构和相关创业公司的实验室阶段。

第一层次和第二层次技术已有相关的上市产品如各种手术模型，个体化的永久植入物（假耳移植物、下颌骨移植物等）。在这两个层次活跃的公司主要以相关的硬件设备及软件厂家为主，其它的3D打印应用服务提供商可基于这些公司的3D打印设备进行个性化的产品定制。

第三层次的产品主要为各类可降解的组织支架，及各类水凝胶支架等。以骨组织工程为例，常用的生物活性、可降解材料包括磷酸钙骨水泥（CPC）、聚乳酸等。这类材料不仅具有较好的生物相容性，还可以与人体组织发生相互关系，促进人体骨组织的再生。也就是说该材料植入进骨缺损部位以后，新长的骨组织能跟植入材料相互融合、界面互相渗透。如果需要的话还可以将材料的降解速度设计的与人骨生长速度相互匹配，也就是随着人体自身骨组织慢慢生长、植入的材料会慢慢降解，当人体的组织完全修复后，材料也全部降解消失。目前这一代材料已广泛应用于临床中的骨缺损修复。

第四层次的产品，主要包括各类人体组织和微型器官。虽然主要还停留在实验室阶段，但也具有了一定的市场应用价值如药物载体系统、高通量药物筛选等。表1详细列举了目前生物医学3D打印技术应用情况及相关代表性公司和产品。

3、生物医学3D打印技术简介

由于第一层次和第二层次的3D打印技术与传统3D打印技术大同小异，大家也都较为熟悉，在此不予赘述。下面主要介绍应用于第三层次和第四层次的3D打印技术，以下生物医学3D打印机均指应用于第三层次和第四层次的3D打印机。

当前主流的生物医学3D打印机按原理主要包括三种类型：激光型生物医学3D的打印机（Laser-based direct writing）、喷墨型生物医学3D打印机（Inkjet-based bioprinting）、挤出沉积型生物医学3D的打印机（Extrusion-based deposition）。

1）激光型生物医学3D打印机

首次将激光技术应用于细胞打印，是由D. J. Odde于1999年提出并应用于2D细胞排布，而最近该项技术被扩展应用于3D细胞打印。如图2所示，为Laser-based型3D打印机原理示意图：主要包括激光脉冲产生器、供体侧滑板、能量吸收层、生物材料、受体侧滑板、基底等几个部分。细胞悬浮于供体侧滑板下生物材料的溶液中，一个激光脉冲将在能量吸收层产生一个气泡，气泡在形成时会产生一个冲击波，而细胞将在该冲击波的作用下被定向传送至受体侧滑板的基底上。在激光的作用下细胞将按设定的模式传送至受体侧滑板的基底上。通过利用激光束与水凝胶的光聚合效应，可以实现LDW打印与支架打印相结合，通过交替沉积细胞层和水凝胶层即可得到三维的细胞组织结构。

通过选择性传送不同类型的细胞到受体侧滑板的基底上可以实现多细胞打印。通过优化生物材料（生物墨水）的粘度、激光打印速度、激光能量以及脉冲频率等参数可以实现微尺度的细胞构图。

2）喷墨型生物医学3D打印机

Inkjet-based bioprinting技术起源于2000年左右。如图3所示，喷墨型3D打印机的工作原理：首先从组织或器官的计算机模型得到的打印数据，然后用一种非接触的影印技术，将由细胞和生物材料组成的“生物墨水”打印至基底上。具体过程为，通过打印喷头里的加热元件，将墨滴里面的水快速加热到200℃，使水产生气化，从而将前面的墨滴喷出去。由于喷墨的过程非常迅速（约20微秒），热量还来不及传递到墨滴，所以不会对细胞产生损害，打印后的细胞存活率大约可以达到95％。通过控制细胞浓度，液滴体积，分辨率，喷嘴直径，细胞的平均直径等工艺参数可以实现单细胞打印和细胞团打印。

3）挤出沉积型生物医学3D打印机

如图4所示，挤出沉积型3D打印机由主要由“流体分配系统”和“三轴自动运动系统”组成。在打印过程中，生物质材料由气压辅助控制系统进行分配，由“三轴自动运动系统”进行位置上的精确定位，从而将丝状生物质材料（细胞被包裹在圆柱形生物丝中）在的空间位置上精进行沉积，形成预期的3D组织。
上述三种类型的3D打印机分别有着各自的优势和劣势，针对不同的生物组织和器官应选择合适的生物制造平台。目前生物医学3D打印技术的发展日新月异，不同类型的3D打印机也在不断的完善和发展。表2分析和归纳了三种不同原理打印机各自的优缺点和科研案例。图5展示了目前已经商业化的生物医学3D打印机。
表2 生物医学3D打印机技术对比

4.1 组织工程与再生医学

说到生物医学3D打印，不得不提两个重要的概念：组织工程(Tissue Engineering) 和再生医学(Regenerative Medicine)。再生医学是一个更宽泛的定义，它包括组织工程，同时还包括身体组织系统的自身修复。

组织工程是一个多学科交叉的研究领域，它充分应用工程科学，生物科学，基础医学的原理，开发制造出具有生物活性的组织或器官替代物，用于保持、替代及修复病变的组织或器官。组织工程的基本原理是：从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞（又称种子细胞）从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料（支架）按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料（支架）上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程有三要素：支架（生物材料）、（干）细胞、以及信号分子。目前组织工程领域较为前沿和热门的思路是利用因子蛋白原位募集体内干细胞并促进其分化对缺损部位进行快速修复，也就是说未来组织工程的趋势，可能连干细胞都省了。由此可见，支架是组织工程技术的核心。

目前广泛开展研究的组织工程方向包括:骨组织工程、皮肤组织工程、血管组织工程、神经组织工程以及其他的一些组织工程。经过二十多年的发展，组织工程无论在基础研究，临床应用，和市场转化方面都取得了非常大的发展，其研究成果已经在很大程度上改变了临床治疗思路，使大量病人受益。
现阶段组织工程主要在以下几个方向不断取得发展和突破.

1）干细胞技术
再生目标组织或器官，通常需要使用相应的细胞，比如再生心脏需要心肌细胞，再生皮肤需要上皮细胞，再生肌肉需要骨骼肌细胞等等。然而很多细胞脱离了自体的原生环境，并不能在体外长期保持其功能和活性，比如肝脏细胞的体外培养一直是一个难题。所以新的细胞来源的取得就显得异常重要。现阶段多能干细胞（Pluripotent Stem Cells）、胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells）、诱导多能干细胞（IPS）、各种特异性的组织干细胞都成为全世界研究人员关注的热点，也相应的取得了一定的进展。

2）新型生物材料
再生具有不同特性的生物组织，需要不同的生物材料。在组织工程发展初期，材料通常被用做支架以支持细胞的贴附和生长。目前新材料的开发主要侧重于其生物学特性，新的材料不但要能作为支架，还要能与细胞相互作用，诱导细胞迁移、扩增、定向分化。同时新材料还被赋予了调节细胞生长的微环境功能，比如释放生长因子，传递信号因子，抑制炎症等等。更加前沿的是，对具有自组装（Self-assembly）能力的新型生物材料而言，其能在外部刺激的情况下，实现在特定时间、特定微环境中的自我组装进而生长成目标组织或器官的形态。虽然这些研究尚处于早期探索阶段，但在可以预见的未来，会出现激动人心的突破成果。

3）信号因子
对于体外细胞的培养，由于缺乏体内的原生环境和相关的信号因子，很难成功的分化为目标组织或器官。经过多年的研究，部分组织定向分化所需的生长因子已经逐渐被确定。然而生长因子的分离和纯化耗时耗力耗钱，所以并不是长期使用的最佳选择。目前这个领域的发展主要侧重于化学小分子、基因、物理刺激等。通过化学小分子的作用，可以激活与生长因子作用相当的生物信号通路，从而诱导细胞分化。其次基因的转导，使细胞本身能在不需要外界刺激的情况下实现分化，并形成相应的生物功能。最后对于不同目标组织分化过程中的物理刺激，比如失重、加压、支架材料的表面结构等等也可以促进细胞的分化。结合新型生物材料，将不同信号因子和材料整合，也是当前的一个研究热点，即所谓的智能材料（Smart Material），比如具有药物缓释功能的支架、加载质粒DNA的水溶胶等等。

4）生物制造方法
生物制造(Biofabrication)是一个相对较新的名词，是利用构成生物体的基本元素（细胞、生长因子、生物材料等等），制造出具有生物功能的组织或器官。最传统的组织工程制造方法就是将细胞装载到3D支架，并在具有生长因子的环境中培养。经过多年的发展，大量针对于不同组织的生物制造方法被开发出来。例如，去细胞化（Decellularization）的重构细胞（Recellularization）已经在实验中用于肝脏、肾脏、心脏等组织工程；细胞膜片（Cell sheet）的3D组装也已经被成功应用于软骨、血管、皮肤等组织，并已经有临床产品用于病人；微组织(Micro-tissue)作为基本结构单元，也被成功用于血管、肝脏组织、肌肉组织等的再生。

当前生物医学3D打印技术的出现，给组织工程和再生医学带来了又一轮新的革命，一种全新的生物制造方法登上了历史的舞台。由于以支架主导的组织工程学对支架的宏观几何尺寸和内部结构都有特定的要求，而生物医学3D打印机可以在空间上对细胞、生长因子、生物材料等实现精确的控制和排列，因此利用生物医学3D打印技术可以实现对支架的微观和宏观结构进行精确控制。

组织工程一直在不断发展和进步，虽然大量的研究成果还仅限于实验室阶段，但也有很多技术进入了临床转化，甚至进入了市场化阶段。随着技术的不断发展，我们有理由相信定制人体组织器官在未来将不再只是一种幻想。

4.2 生物医学3D打印面临的挑战

生物医学3D打印技术与组织工程技术之间既相互联系，又有所区别。生物医学3D打印技术为组织工程提供了前所未有的精密的生物制造方法，组织工程技术为生物医学3D打印提供基本的生物学理论和技术支撑。组织工程技术以支架为导向，当前的研究趋势是利用因子蛋白原位募集体内干细胞并促进其分化对缺损部位进行快速修复。而生物医学3D打印技术的当前研究热点则是试图抛弃支架，建立以细胞、生长因子为导向的无支架3D生物打印体系。

尽管组织工程在干细胞技术、新型生物材料、信号因子、生物制造方法等方面已经取得了较大的进展，但是对于再生一个和人类器官一模一样的人造组织而言，这还只是万里长征的第一步。对生物医学3D打印而言还有很多基本的生物学问题有待科学家的探索和解决。
生物医学3D打印技术主要存在下面三个方面的难点：

1）细胞技术的挑战
尽管组织工程在干细胞技术上取得了较大的发展，但是器官制造需要多种类型的特异性细胞，基于目前的细胞隔离和分化技术，是难以满足要求的。
除此之外，尽管干细胞技术提供了巨大的潜能——可以作为一个无限的细胞来源，但是人类目前对分化过程的机制和控制方法的尚缺乏更深刻的理解，而这一步对产生可扩展的与预期的细胞表型一致的器官特异性细胞至关重要。

2）生物制造技术的挑战
3D打印形成的组织或者器官除了需要保证细胞活性外，还需能迁移、增殖和分化。一个最基本的要求是细胞需能进行正常的新陈代谢，而没有血管化组织，细胞就无法进行新陈代谢。现在的生物3D打印技术还无法实现多尺度的组织制造，而各种血管分支和毛细血管需要同时被打印，从而模拟真实的血管网络。因此现有的生物3D打印技术还不能制造具有功能性的血管化网络组织。而血管化的组织对器官的制造而言是最为关键的一步。

3）体内整合技术的挑战
如果人造组织和器官得已形成，还需要保证其植入人体内后能被免疫系统所接受，这也是目前组织工程需要探索的问题。

结语：
如果说3D打印一个具有生物学功能的活体器官是修建一座漂亮的房子，那我们还仅仅只是学会了用砖头垒一个简陋的小灶。生物医学3D打印的发展，组织工程任重而道远。为了人类的这个终极目标，生物3D打印虽路漫漫，其修远，然吾辈当上下而求索！
注明：文章来源安美生物医学3D打印
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